In einem Reagenzglas werden je 2 ml Fehlings Reagenz I mit 2 ml Fehlings Reagenz II vermischt und danach mit dem Brenner zum Sieden oder im Wasserbad auf 90 °C erhitzt. Von der zu untersuchenden Substanz gibt man dann eine Spatelspitze (oder wenige Tropfen) hinzu. Beim Vorhandensein von Einfachzuckern wie Glucose oder Fructose, bei aliphatischen Aldehyden, aber auch bei Lactose und Maltose fällt ein gelbroter oder kupferroter Niederschlag aus. Die Verfärbung tritt dagegen bei Ketonen und bei der Saccharose nicht auf. 

Fehlingsche Lösung I besteht aus einer wässrigen Lösung von Kupfer(II)-sulfat. Dieses bildet beim Zusammenschütten mit dem Kaliumnatriumtartrat und der Natronlauge der Lösung II einen tiefblauen Tartrato-Kupfer(II)-Komplex. Der beim Nachweis entstehende rote Niederschlag besteht im Wesentlichen aus Kupfer(I)-oxid Cu₂O, das beim Erwärmen der Fehlingschen Lösung mit dem reduzierenden Zucker entsteht. Saccharose ist kein reduzierender Zucker. Der von dem deutschen Chemiker Hermann Fehling im Jahr 1848 eingeführte Test kann auch zur Blutzucker-Bestimmung im Harn angewandt werden. 

In der Fehlingschen Lösung ist ätzende Natronlauge enthalten. Auch das Kupfer(II)-sulfat aus der Lösung I wirkt augen- und hautreizend. Es müssen Schutzbrille und Schutzhandschuhe getragen werden. Nach der Arbeit sind die Hände gründlich zu waschen! Die Reste müssen im Gefäß für Schwermetallsalz-Lösungen entsorgt werden, da Kupferverbindungen für Wasserorganismen toxisch wirken. Eine Alternative zur Fehling-Reaktion, bei der ja mit einem stark ätzenden Stoff gearbeitet wird, ist der Nachweis reduzierend wirkender Zucker mit Benedict-Reagenz.